Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА), или реакция пассивной гемагглютинации (РПГА)
Основана на том, что эритроциты, на которых предварительно адсорбированы антигены, приобретают способность агглютинироваться в присутствии гомологичных сывороток (антител).
Эритроциты при этом выполняют роль носителей со специфическими детерминантами, агглютинация которых происходит в результате реакции антиген + антитело.
Эритроциты, к поверхности которых прочно присоединены антигены, называют эритроцитарным антигенным диагностикумом, или эритроцитами, сенсибилизированными антигеном.
Другой тип РНГА — на поверхности эритроцитов адсорбированы антитела и последующая их агглютинация происходит в присутствии гомологичного антигена. В этом случае такие эритроциты называют эритроцитарным антительным диагностикумом, или эритроцитами, сенсибилизированными антителами.
На основе этих двух принципиальных методических подходов разработаны и используются многие модификации РНГА. Так, в качестве носителей применяют мелкие стандартные частички латекса. В этом случае реакцию называют реакция латекс агглютинации (РЛА) или используют золотистый стафилококк — реакция коагглютинации и т. д. Обычно эритроцитарные диагностикумы готовят на предприятиях биологической промышленности, а в диагностических лабораториях ставят уже главный опыт РНГА.
Реакция Украинца, впервые посетившего Ригу #Латвия: Riga Latvia vlog
Приготовление эритроцитарных диагностикумов включает следующие этапы:
- фиксация эритроцитов формальдегидом или глютаровым, или акриловым альдегидами. Такие обработанные эритроциты длительно сохраняются. Чаще для этой цели используют эритроциты барана, человека, кур и др.;
- обработка фиксированных эритроцитов раствором танина. В результате эритроциты приобретают свойство необратимо адсорбировать на своей поверхности белки (вирусы и антитела);
- сенсибилизация танизированных эритроцитов вирусами или антителами.
Необходимо отметить, что методы приготовления эритроцитарных диагностикумов для вирусных инфекций различна.
Методика постановки РНГА для обнаружения и определения титра антител заключается в следующем:
- к последовательным 2-кратным разведениям сыворотки добавляют равные дозы эритроцитов, сенсибилизированных антигеном;
- смесь оставляют на 2—3 ч при комнатной температуре или на 16—18 ч при 4 °С;
- учитывают результаты. Если в сыворотке содержатся антитела к вирусу, которым были сенсибилизированы эритроциты, наблюдают гемагглютинацию, которую оценивают в крестах.
За титр антител в сыворотке принимают наивысшее разведение сыворотки, которое еще обеспечивает гемагглютинацию не менее чем на два креста.
РНГА сопровождается всеми соответствующими контролями. Обычно ставят реакцию микрометодом.
РНГА позволяет решать следующие диагностические задачи:
- обнаружить антитела и определить их титр в сыворотке крови с помощью известного эритроцитарного антигенного диагностикума;
- обнаружить и идентифицировать неизвестный вирус с помощью известного эритроцитарного антительного диагностикума.
Достоинства РНГА: высокая чувствительность, простота техники постановки и быстрота ответа. Однако важно отметить, что возникают большие трудности в приготовлении стабильных эритроцитарных диагностикумов (большая зависимость от чистоты используемых компонентов, необходимость подбора режима фиксации, танизации и сенсибилизации эритроцитов для каждого вида вируса).
Реакция персонажей «Всё ради игры» на Натаниэля. 2/2
ИсточникРеакция гемагглютинации (РГА)
В пробирках (обычно восьми) готовят серию двойных разведений препарата на питательной среде. Объём среды в каждой пробирке составляет 1 мл. Контролем служит пробирка, содержащая чистую питательную среду. В 1-ю пробирку вносят 1 мл исследуемого материала. Содержимое 1-й пробирки перемешивают и 1 мл переносят во 2-ю пробирку, из 2-й — в 3-ю, из 3-й — в 4-ю и так далее.
Пробирки инкубируют 10-18 ч при 37 °С (или до появления бактериального роста в контрольной пробирке). По истечении указанного срока результаты учитывают по изменению оптической плотности среды визуально или нефелометрически. Рост микроорганизмов сопровождается изменением рН среды и, соответственно, окраски индикатора.
Короткий пестрый ряд
Короткий «пестрый ряд» включает жидкие среды Гисса с моно- и дисахаридами: глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой и с 6-атомным спиртом — маннитом.
Чистую культуру исследуемого микроорганизма засевают петлей в среды «пестрого ряда». Посевы инкубируют при 37 °С в течение 18—24 ч или больше. В том случае, если бактерии ферментируют углевод до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды
Поскольку бактерии ферментируют не все, а только определенные для каждого вида углеводы, входящие в состав сред Гисса, наблюдается довольно пестрая картина, поэтому набор сред с углеводами и цветным индикатором называют «пестрым рядом».
Культуральные свойства бактерий
К культуральным (или макроморфологическим) свойствам относятся характерные особенности роста микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах. На поверхности плотных питательных сред, в зависимости от посева, микроорганизмы могут расти в виде колоний, штриха или сплошного газона.
Колонией называют изолированное скопление клеток одного вида, выросших из одной клетки (клон клеток). В зависимости от того, где растет микроорганизм (на поверхности плотной питательной среды или в толще ее), различают поверхностные, глубинные и донные колонии.
Колонии, выросшие на поверхности среды, отличаются разнообразием: они видоспецифичны и их изучение используется для определения видовой принадлежности исследуемой культуры.
При описании колоний учитывают следующие признаки:
1) форму колонии — округлая, амебовидная, ризоидная, неправильная и т. д.;
2) размер (диаметр) колонии — очень мелкие (точечные) (0,1-0,5 мм), мелкие (0,5-3 мм), средних размеров (3-5 мм) и крупные (более 5 мм в диаметре);
3) поверхность колонии — гладкая, шероховатая, складчатая, морщинистая, с концентрическими кругами или радиально исчерченная;
4) профиль колонии — плоский, выпуклый, конусовидный, кратерообразный и т. д.;
5) прозрачность — тусклая, матовая, блестящая, прозрачная, мучнистая;
6) цвет колонии (пигмент) — бесцветная или пигментированная (белая, желтая, золотистая, красная, черная), особо отмечают выделение пигмента в среду с ее окрашиванием;
7) край колонии — ровный, волнистый, зубчатый, бахромчатый и т. д.;
8) структуру колонии — однородная, мелко- или крупнозернистая, струйчатая; край и структуру колонии определяют с помощью лупы или на малом увеличении микроскопа, поместив чашку Петри с посевом на столик микроскопа крышкой вниз;
9) консистенцию колонии; определяют прикасаясь к поверхности петлей: колония может быть плотной, мягкой, врастающей в агар, слизистой (тянется за петлей), хрупкой (легко ломается при соприкосновении с петлей).
Реакция агглютинации
В этих реакциях принимают участие антигены в виде частиц (микробные клетки, эритроциты и другие корпускулярные антигены), которые склеиваются антителами и выпадают в осадок.
Для постановки реакции агглютинации (РА) необходимы три компонента: 1) антиген (агглютиноген); 2) антитело (агглютинин) и 3) электролит
Аг + АТ + электролит = агглютинат
1.Постановка ориентировочной реакции агглютинации (РА) на стекле с целью идентификации бактерий кишечной группы.
На предметное стекло наносят каплями:
1-ая капля: — агглютинирующая сыворотка к возбудителям дизентерии;
2-ая капля: — агглютинирующая сыворотка к возбудителям брюшного тифа;
3-ья капля: — физиологический раствор (контроль).
Добавляют в каждую каплю исследуемую чистую культуру бактерий. Перемешивают.
Примечание: положительный результат — наличие хлопьев агглютината,
отрицательный — отсутствие хлопьев агглютината
Вывод: в исследуемом материале найден искомый антиген в малом количестве.
РЕАКЦИЯ ТОРМОЖЕНИЯ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ(РТГА)
Гемагглютинины вирусов склеивают эритроциты. Это свойство используют в реакции гемагглютинации для индикации и титрования вирусов, что необходимо для последующей постановки РТГА.
Реакция торможения гемагглютинации основана на блокаде, подавлении антигенов (гемагглютининов) вирусов антителами иммунной сыворотки, в результате чего вирусы теряют свойство агглютинировать эритроциты. РТГА применяют для диагностики многих вирусных болезней, возбудители которых (вирусы гриппа, кори, краснухи, клещевого энцефалита и др.) могут агглютинировать эритроциты различных животных.
Положительная реакции — осадок в виде «зонтика», отрицательная — в виде «пуговицы».
Вывод:реакція положительная в 1 ряду с сывороткой типа А, т.к. произошло торможение гемаглютинации, следовательно заболевание визвано вирусом типа А.
Реакция гемагглютинации (РГА)
Различают прямую и непрямую РГА. При прямой гемагглютинации происходит подавление вирусов антителами иммунной сыворотки, в результате чего вирусы теряют свойство агглютинировать эритроциты. Эту реакцию широко используют для диагностики некоторых вирусных инфекций, например гриппа.
При реакции непрямой гемагглютинации (Рига) происходит склеивание эритроцитов при адсорбции на них определенных антигенов. При этом эритроциты оседают на дно пробирки в виде фестончатого осадка. Рига применяют для диагностики различных инфекционных заболеваний, для выявления чувствительности к лекарственным препаратам и гормонам.
Иммунофериентный анализ, или метод (ИФА) –
выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, бета-галактозидазной и или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченой ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расщепляется ферментом и изменяется цвет продукта реакции — интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. ИФА применяют для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных болезней.
Вывод: реакция положительна в первой и второй лунке, т.к. цвет изменился на ярко желтый, что говорит о наличии специфических антител сыворотки.
«Цветная» проба
«Цветная» проба оценивается по изменению цвета индикатора (феноловый,красный), находящегося в питательной среде культивирования. Если вирусы не размножаются в культуре клеток, то живые клетки в процессе метаболизма выделяют кислые продукты, что ведет к изменению рН среды и,,соответственно, цвета индикатора (среда становится желтой).При репродукции вирусов нормальный метаболизм клеток нарушается (клетки гибнут), и среда сохраняет свой первоначальный цвет (красный).Данная проба подходит к вирусам с коротким периодом репродукции.
Вывод: реакция положительная в первой пробирке, т.к. цвет не изменяется, следовательно в материале присутствует вирус.
Задачи и функции аптечной организации: Аптеки классифицируют на обслуживающие население; они могут быть.
ИсточникРеакция непрямой гемагглютинации (Рига)
Одной из разновидностей метода непрямого иммунологического анализа, используемого для диагностики гриппа, является Рига. Принцип Рига основан на способности эритроцитов, адсорбировавших вирусы, агглютинироваться в присутствии антител иммунной сыворотки [Исаченко В. А., Соковых Л. А., 1964; Авророва Р. И., 1966]. Установлено, что использование танина для приготовления эритроцитарного диагностикума из вируссодержащей аллантоисной жидкости снижает специфичность Рига, а сенсибилизированные таким образом эритроциты неустойчивы при длительном хранении. Э. П. Корнеева, Я. С. Шварцман (1972) разработали микрометодику Рига, успешно используемую для диагностики гриппа.
Действующим началом диагностикума служит вирус гриппа, очищенный сорбцией — элюцией и ультрацентрифугированием. Для прочной фиксации вируса на эритроцитах барана, обработанных формалином, авторы использовали бидиазотированный бензидин (БДБ).
Лиофилизация комплекса вирус — эритроцит обеспечивала получение препарата с неограниченным сроком годности, что сделало возможным централизованное изготовление диагностикума для Рига. В Центральной серологической лаборатории ВНИИ гриппа МЗ СНГ А. Н. Найхин (под руководством А. А. Смородинцева и Л. Ю. Тарос) сравнил чувствительность и специфичность Рига с РТГА, РСК и РН для диагностики гриппозной инфекции с сыворотками:
При этом наиболее высокие диагностические показатели сероконверсий отмечались в Рига и РН у больных гриппом и иммунизированных добровольцев. Наименьшее число сероконверсий выявляла РТГА. Диагностические показатели РНГА приближались к результатам РСК при естественной гриппозной инфекции. Отмечалось значительное отставание РСК при иммунизации умеренно аттенуированным вирусом гриппа и после прививок живой вакциной. Наибольшее число совпадений положительных результатов диагностики гриппозной инфекции у реконвалесцентов и у привитых умеренно аттенуированным вирусом волонтеров было отмечено по данным РНГА и РН. По сравнению с РТГА у 27,3 % волонтеров РНГА дополнительно диагностировала достоверное нарастание уровня антител, а по сравнению с РСК — у 36,4 %.
Диагностическое обследование больных детей в эпидемию 1972 — 1973 гг., вызванную вирусом гриппа А разновидности А/Виктория/35/72, показало наибольшее превосходство РНГА и РСК перед РТГА по сравнению с результатами обследования сывороток взрослых. Наблюдалось отсутствие различий в диагностических показателях РНГА В эпидемический и межэпидемический периоды, что было характерно также для РСК, в противоположность указанному выше резкому отставанию по данным РТГА. Исследование парных сывороток волонтеров, получивших вирус гриппа А, в РНГА, РН, РТГА и РСК с гомологичным вирусом и с гетерологичным вирусом гриппа В показало весьма высокую специфичность РНГА, не уступающую аналогичным показателям РН и РТГА. Это подтверждается также наличием корреляций между исходным уровнем антител в сыворотках волонтеров по данным РНГА и степенью клинических реакций на введение им умеренно аттенуированного вируса А/Гонконг/68. В связи с высокой чувствительностью, простотой постановки, отсутствием влияния неспецифических ингибиторов, а также стабильностью лиофилизированных эритроцитарных препаратов при длительном хранении РНГА используют для серологической диагностики гриппа.
По данным Н. А. Ивановой (личное сообщение), РНГА характеризуется не штаммовой, а типовой специфичностью, выявляя антитела к подтипам вируса гриппа A(H0N1, H1N1, H2N2, H3N2), т. е. к внутренним антигенам, общим для всех штаммов вируса гриппа А. Это может объясняться, по мнению А. А. Смородинцева, активным липидорастворяющим действием бензидина, используемого для фиксирования на мембране эритроцитов вирионов, превращающихся под влиянием БДБ в «растворимый» антиген. Невозможность дифференцировать антитела к вирусу гриппа А разных подтипов ограничивает применение РНГА для решения задач иммунологии гриппозной инфекции, требующих методов, которые позволяют более точно охарактеризовать специфичность сывороточных или секреторных антител при изучении иммунных сдвигов у реконвалесцентов и особенно у людей, получивших гриппозные вакцины.
Не менее важно для диагностики гриппа и определение уровня антител ко второму по важности антигенному компоненту вируса гриппа — нейраминидазе (NA), что позволяет более полно оценить состояние противогриппозного иммунитета. Наряду с рекомендованным ВОЗ более сложным способом определения антинейраминидазных антител, пригодны и более простые методики определения сывороточных антител к нейраминидазе [Holston Г., Dowdle W., 1973].
Один из таких приемов, основанный на РНГА, выполняется с ипользованием бараньих эритроцитов, обработанных танином и сенсибилизированных нейраминидазой, изолированной электрофоретически из высокоочищенного рекомбинантного вируса гриппа. При исследовании сывороток от реконвалесцентов и людей, привитых против гриппа, этот диагностикум выявил высокий процент положительных результатов по сравнению с реакцией ингибиции нейраминидазы (РИНА).
Указанный способ прост в выполнении и более чувствителен, чем другие реакции титрования антинейраминидазных антител. Более простой способ титрования антинейраминидазных антител основан на принципе ингибиции элюции (РИЭ) [Арpleyard L., Oran G., 1977]. Для проведения реакции необходимы антигенные рекомбинанты с гетерологичным неактуальным гемагглютинином и гомологичной нейраминидазой. Сравнительное изучение в РИНА и РИЭ 160 сывороток здоровых людей в возрасте 16 — 18 лет показало более высокую чувствительность РИЭ, чем РИНА [Топурия Н. В. и др., 1980; Найхин А. Н. и др., 1980].
Источник